Le malattie metaboliche ereditarie possono essere diagnosticate ricercando metaboliti anomali o o abnormi concentrazioni di metaboliti normali nei fluidi biologici. Alcune tecniche vengono usate per gli screening metabolici di routine: gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) per la determinazione degli acidi organici, cromatografia a scambio ionico per determinare gli aminoacidi e cromatografia ad alta performance (HPLC) per la determinazione di purine e pirimidine.
Nel 1985 furono diagnosticate alcune acidurie organiche utilizzando la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Al contrario di altre tecniche, la spettroscopia NMR è in grado di individuare simultaneamente i differenti gruppi chimici dei metaboliti; è un tipo di analisi multicomponente che può essere applicata a matrici complesse.
Gli spettri 1H-NMR dei fluidi biologici possono essere usati per l'identificazione e la quantificazione di metaboliti contenenti protoni. Altro vantaggio della tecnica NMR rispetto ai metodi convenzionali è il fatto che il campione non richiede pretrattamento. Lo spettro NMR di un fluido biologico dà quindi un quadro generale di tutti i metaboliti contenenti protoni ed il limite di rivelabilità dei medesimi dipende da vari fattori come la potenza del campo magnetico impiegato, la molteplicità del segnale, il numero di protoni che contribuiscono alla risonanza e la la regione dello spettro in cui la risonanza è osservata (più o meno ricca di segnali). Aumentando il campo magnetico abbiamo una maggiore sensibilità ed un conseguente minore limite di rivelabilità.
Solo alcuni gruppi di ricerca sono impegnati ad utilizzare la tecnica per la diagnosi di malattie metaboliche ereditarie, in particolare in Europa, un gruppo Olandese studia difetti congeniti legati al metabolismo di: purine e pirimidine, acidi organici, amminoacidi ed acidi grassi, inoltre vengono esaminati disturbi lisosomiali e perissosomiali più altri disturbi come la trimetilamminuria, la deficienza da dimetilglicina, la deficienza da metiltetraidrofolato riduttasi e varie altre deficienze enzimatiche che si riflettono nell' escrezione abnorme o nell'assenza di un determinato metabolita nelle urine.
Una volta stabilita la fattibilità, tre anni fa, abbiamo iniziato uno screening su campioni provenienti dalla U.O. Neuropsichiatria Infantile dell'Azienda Ospedaliera Universitaria Senese in collaborazione con il Dr. Joseph Hayek.
Una sindrome ben evidenziata anche dall'analisi NMR è stata quella di Canavan in cui l'escrezione massiccia di acido N-acetilaspartico rappresenta il marker biochimico della malattia.
Sindromi invece più complicate da evidenziare sono state 9 acidurie organiche da acido etilmalonico, confermate da analisi effettuate con altri metodi (HPLC e Gas Massa). L'eliminazione di questo acido nelle urine suggerisce un disturbo nella degradazione degli acidi grassi a catena corta legato ad una deficienza dell'enzima acil-CoA deidrogenasi (SCAD). Allo stato attuale solo una ventina di casi al mondo di ragazzi affetti da questa patologia sono stati confermati, dimostrando la malattia una estrema variabilità dei sintomi (Seidel et al. J.Inherit. Metab. Dis. 26, 2003, 37-42). I pazienti sono in studio presso la U.O. Di Genetica Medica.
Diversi casi con diagnosi di sindrome di Rett hanno evidenziato elevati livelli di creatina. Anche in molti casi di autismo i livelli di creatina sono risultati elevati.
Numerosi casi più o meno gravi di soggetti affetti da ritardo mentale, hanno mostrato elevate escrezioni di 1-metilistidina, altri di carnosina ed anserina.
In due soggetti è stata riscontrata una abnorme escrezione urinaria di trimetilammina (TMA). Questa sostanza conferisce alle secrezioni corporee un caratteristico odore di pesce marcio; la TMA deriva dal metabolismo enterobatterico di precursori dietari tipo colina, lecitina, carnitina ed altre betaine e viene normalmente ossidata dal fegato in ossido di trimetilammina (TMAO) che è inodore. Una trimetilamminuria elevata significa un difetto nella capacità di ossidazione e in soggetti che non abbiano problemi epatici o renali, come nei nostri casi, la responsabilità è da attribuire ad un gene, l'FMO3, non in grado di amplificare i suoi esoni dal DNA genomico. Si ha una sostituzione da prolina a leucina nel residuo 153 e questa modificazione abolisce l'attività catalitica delle flavine contenenti monossigenasi (FMO) che appunto catalizzano la reazione di ossidazione da TMA a TMAO.
Recentemente è stato riscontrato un caso di sarcosinuria. Elevati livelli di sarcosina nelle urine sono stati descritti in letteratura in soggetti con sarcosinemia primaria dovuta a deficit dell'enzima sarcosina deidrogenasi; si tratta di un flavoenzima della matrice mitocondriale delle cellule epatiche. E' un difetto raro autosomico che può comportare ritardo mentale ed anomalie nella crescita dei pazienti.
Sono stati infine riscontrati molti casi di aciduria da acido betaminoisobutirrico in ragazzi con diagnosi di iperattività (36% rispetto al 10% dei soggetti di controllo).
Recentemente, abbiamo avuto modo di misurare campioni di soggetti con diagnosi già definita presso il Laboratorio della Clinica Pediatrica di: aciduria glutarica, aciduria metilmalonica e cistinuria. Gli spettri registrati confermano la presenza di acido glutarico e di metilmalonico, nei primi due campioni e di lisina, arginina ed ornitina nel caso della cistinuria. La cistina in sé non compare nello spettro NMR per la sua scarsa solubilità in solventi polari, ma i suoi cristalli sono presenti nel sedimento in notevole quantità come abbiamo potuto constatare all'esame microscopico.

Sindrome di Canavan


Aciduria Etilmalonica


TMAuria


Sarcosinuria


Aciduria Metilmalonica


Aciduria Glutarica


Cistinuria


Cristalli di tripolifosfati


Cellule epiteliali squamose


Cristalli di cistina


Cristalli di Ossalato


Cristallo di cistina